1. Les différences entre SPE, HPLC et Flash Prep LC
SPE (pour Sample prep Extraction)
- Processus séparatif discontinu
- Analytes de polarités et structures différentes
- Echantillons de mélanges complexes dans lesquels se trouvent un grand nombre de solutés parasites perturbant la séparation
LC (pour Liquid Chromatography)
- Processus séparatif continu
- Analytes de polarités et structures voisines
- Solutions injectées relativement propres
LC prep & Flash
- Processus séparatif continu
- Analytes de polarités et structures voisines
- Mélanges à purifier plus ou moins propres
| Chromatographie (HPLC, prep LC, Flash) |
Extraction (SPE,SLE) |
|
| Processus séparatif | Continu | Discontinu |
| Solutés dans la colonne | Toujours en mouvement | Bloqués puis décrochés |
| Composition phase mobile | Soit constante (analyse isocratique) Soit changée continûment (gradient) |
Changée pas à pas |
| Type de séparation | Chromatographie d’élution | Chromatographie frontale |
| Volume de la colonne occupé: par les analytes par la seule phase mobile |
1 à 2 % (HPLC) 99-98 %(HPLC) |
100 % 0 % |
| Constituants de l’échantillon | Solutés de polarités voisines | Solutés de polarités différentes |
| Utilisation | Réutilisable | “One Shot” |
| Coût de fonctionnement | Moyen à élevé | Faible |
| Coût de l’appareillage | Elevé | Faible |
2. SPE & HPLC > Définitions
SPE
Elle sert à pré-séparer des solutés de structures différentes et à les recueillir dans un minimum de solvant. D’où les longueurs très courtes des cartouches de SPE. Pour que la SPE sépare les solutés d’intérêt, on doit travailler avec des facteurs de sélectivité supérieurs à 4. Le mode step gradient facilite la séparation. La SPE est une chromatographie fonctionnant à très grande sélectivité.
HPLC
Compte tenu de l’efficacité des supports de petit diamètre de particules et des longueurs de colonnes usuelles, on percolera la colonne en continu par la phase mobile et on séparera facilement des solutés avec un facteur de sélectivité de 1,05.
En conclusion, les lois permettant de choisir la phase mobile sont les mêmes en LC et en SPE mais elles seront utilisées selon des critères différents.
3. Caractéristiques des phases stationnaires utilisées en HPLC, Flash et SPE
| HPLC | Flash | SPE | |
| Diamètre des particules | 1,7 à 10 µm | 15 – 50 µm | 30 à 140 µm |
| Compacité du remplissage | Forte | 15 – 50 µm | Forte |
| Effets extra colonne | Faibles (si optimisés) | – – – | Forts |
| Longueur de colonne | 3 à 30 cm | 5 à 50 cm | ~ 1 à 2 cm |
| Efficacité (Nombre de plateaux) | 5000 à 6000 | 1000- 5000 | ~ 10 à 50 |
| Sélectivité nécessaire | Faible | Moyenne | Forte |
| Polarité des analytes | Peu différente | Peu différente | Très différente |
| Diamètre des pores | 60 – 150 Å | 60 – 150 Å | 60 – 150 Å |
| Surface spécifique | 50 – 450 m2/g | 50 – 450 m2/g | 500 – 1500 m2>/g |
Réalisée en collaboration avec l’Université Paris-Sud, Pr A. Tchapla & Dr S. Héron, LETIAM, IUT d’Orsay, Orsay, France.
4. Influence de la taille des particules
En SPE, le diamètre des particules varie de 30 à 140 μm, les longueurs de lit de 1 à 2 cm.
En HPLC, le diamètre des particules est compris entre 1,7 et 5 μm, les longueurs classiques de colonne entre 5 et 25 cm.
En prep LC et Flash, le diamètre des particules varient de 10 à 50 μm, les longueurs des colonnes de 5 à 50 cm.
Pour une même phase stationnaire, si seul le diamètre de particules diffère (mêmes solutés, même phase mobile, même température) :
- la rétention et la sélectivité ne seront pas affectées
- la résolution sera changée (les longueurs des colonnes affectent également le nombre de plateaux).
| Efficacité théorique | Ø des particules | Applications |
| 5 000 plateaux/m | 50 µm | Flash purification SPE |
| 20 000 plateaux/m | 15 µm | Flash purification SPE prep LC |
| 33 000 plateaux/m | 10 µm | prep LC |
| 80 000 plateaux/m | 5 µm | Analytique |
| 130 000 plateaux/m | 3 µm | Analytique |
| 180 000 plateaux/m | 2,2 µm | Analytique UHPLC |
| 220 000 plateaux/m | 1,7 µm | UHPLC |
Classiquement une colonne d’HPLC analytique de longueur 25 cm, remplie de particules de 5 µm développe une efficacité de l’ordre de 20 000 plateaux en routine. Une cartouche de SPE de longueur 1,25 cm remplie de particules de 50 µm développe une efficacité de l’ordre de 50 plateaux.
